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一名记者的CRISPR初体验:连傻瓜都会使用因编辑工具

更新时间  2021-08-01 20:43 阅读
本文摘要:我对生物学涉及科学知识有一定的了解,但当我查询的新基因编辑技术CRISPR涉及科学知识时,我有些气馁。这个技术看起来很复杂!但是一个研究人员告诉他,CRISPR(全名clusterdreruglisinterspacedshortalinomicreplicates)只是听起来很可怕,而且使用起来非常简单,连傻子都可以用。我指出我比傻子聪明多了,然后我想检验这句话的真实性。于是,我无聊的开始了我的第一次CRISPR体验。

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我对生物学涉及科学知识有一定的了解,但当我查询的新基因编辑技术CRISPR涉及科学知识时,我有些气馁。这个技术看起来很复杂!但是一个研究人员告诉他,CRISPR(全名clusterdreruglisinterspacedshortalinomicreplicates)只是听起来很可怕,而且使用起来非常简单,连傻子都可以用。我指出我比傻子聪明多了,然后我想检验这句话的真实性。于是,我无聊的开始了我的第一次CRISPR体验。

相关数据显示CRISPR在抑制或敲除基因方面效果最好,所以我想试试CRISPR敲除基因。我设定了一个雄心勃勃的目标:用CRISPR敲除一个免疫系统基因,而我,庞加莱,敲除这个基因,可以增加寨卡病毒造成的伤害。一旦进展顺利,将极大地推动对寨卡病毒的研究!(我的假设是,如果一个个体已经感染了登革热,并且有针对该病毒的抗体,那么CD32可能有助于驱动寨卡病毒的自我复制。

加利福尼亚州圣地亚哥的桑福德伯恩汉姆普雷比医学发现研究所的苏米查达实验室博士后罗兰阿格纳同意担任我的克里斯普导师。来自奥地利的瓦格纳是一个经验丰富的攀岩者,他讨厌有条不紊地完成工作。他查询分析了CD32基因的序列,CD32有五个不同的蛋白编码区。如果我们切入其中一个蛋白质编码区的DNA,基因很可能会被敲除,仍然会传递CD32蛋白。

生物学家RolandWagner(左)指导JonCohen开发并构建了CRISPR系统,该系统用于一行RNA,以将Cas9分子剪刀CRISPR的一部分引导到基因组中的准确位置。我们可以卖一行RNA(gRNA),但华格纳不想这么甜。

他认为他不确定gRNA的价格是多少,但假设卖gRNA要花500美元,而且他们自己准备,只要5美元。GRNA序列可以与我们要切割的CD32基因上的20个核苷酸序列进行排序。但是在基因组的其他部分可能没有这种短序列那么宽的片段,不会导致分子剪刀切入错误的位点。这种离靶效应不会严重影响实验结果,避免离靶效应是CRISPR研究的关键目标。

为了使CRISPR具有高度特异性,Cas9必须有一个额外的序列:N-G-G,其中N可以是任何核苷酸。当Cas9在20个靶核苷酸后发现N-G-G时,它立即融合并闭合DNA双螺旋,然后gRNA与靶序列结合。最后Cas9被切割成两股DNA。

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为了制作gRNA,Wagner把我们测试的CD32序列粘贴到免费数据库OptimizedCRISPRDesign中,查询N-G-G旁边突出的20个核苷酸序列,遇到了我们的拒绝。CD32中还有41个附加片段。该数据库扫描整个人类基因组,以检查在其他地方是否没有潜在的具有相同序列的非目标位点。

我们自由选择了一个只在CD32中不存在的序列。然后瓦格纳关闭了另一个网站,购买了DNA序列。DNA序列报废了,第一次用移液器试。三十多年前毕业后就没在实验室工作过。

当时我学了一个可能是LouisPasteur发明的移液技术:我把一根手指放进嘴里,然后把一种化学物质吸进一根粗玻璃管里,然后用指尖盖住玻璃管。


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